0 引言 Introduction

骨质疏松症是一种以骨量丢失、骨组织的微小结构破坏，引起骨强度下降和骨脆性增加为特征的全身代谢性疾病，其临床表现以疼痛、脊柱弯曲为主[1]。骨质疏松症被传统医学认为属于“骨痿”“骨枯”等范畴。目前临床中医药治疗在辨证论治的指导下具有明显的疗效和优势[2-3]，能较好的改善西药治疗的药物不良反应及安全性问题。中药及中药复方有效活性成分众多，但部分化学成分尚不明确，且中药成分于复杂的机体内分泌及代谢环境中的作用机制尚不清楚[4]。随着蛋白质组学发展迅速以及生物信息学理论的建立，逐步解决了中药复方作用机制方面检测灵敏度不高、可靠评价指标少等问题[5]，并为中药复方治疗疾病的作用靶点研究提供了一个新的研究策略。

骨疏康胶囊是一种治疗骨质疏松症的中成药，其有服用方便、疗效稳定、不良反应小的特点[6]，已被临床广泛应用。已有研究表明骨疏康能减少骨质疏松症小鼠的骨细胞凋亡、提高骨密度和骨矿含量，能较好的调节骨质疏松症患者骨代谢水平[7-8]，改善临床症状。同时最近研究表明骨疏康可促进破骨细胞凋亡、抑制骨质疏松大鼠的骨吸收，从而延缓骨丢失和治疗骨质疏松症[9]。但目前骨疏康治疗骨质疏松症的具体机制及作用靶点尚不明确，且基于分子水平相关研究报道较少，故仍需深入探究。此次研究利用TMT(Tandem mass tag，TMT)标记联合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术研究骨疏康干预骨质疏松症大鼠腰椎的差异蛋白表达，运用生物信息学进行GO 及信号通路分析，预测骨疏康治疗骨质疏松症可能的作用靶点，进一步阐释其保护骨质疏松症大鼠骨代谢的作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018 年9 月至2019 年9 月分别于在福建省中医药科学院比较学中心和福建省中医药科学院基础研究所实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 36 只3 月龄清洁级雌性SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005，合格证编号：2；在福建省中医药科学院比较医学实验中心继续饲养至6 月龄，实验许可证号：SYXK(闽) 2009-000。各组动物在温度20-22 ℃，适宜湿度和光照的环境中饲养。

1.3.2 实验药物、试剂与仪器 骨疏康胶囊(辽宁康辰药业有限公司，国药准字：Z)，主要成分：淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜籽；BCA 定量试剂盒(中国碧云天)；SDT 裂解液、TMT 标记试剂盒(美国Thermo Fisher 公司)；Discovery W 双能X 射线骨密度仪(变异系数1.0 CV%，精度0.25%，美国Hologic 公司)；Q-Exactive 质谱仪(美国Thermo Fisher 公司)；Easy nLC 色谱系统 (美国Thermo Scientific)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模及给药 36 只6 月龄大鼠按照随机数字表法分成骨疏康组(n=12)、模型组(n=12)、假手术组(n=12)。根据文献方法施行大鼠双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型[9]；假手术组切除卵巢旁等体积的脂肪组织。术后3 d 肌注青霉素80 万单位/d。造模后，骨疏康组大鼠给予骨疏康灌胃[骨疏康换算后给药量为4.32 g/(kg·d)，用生理盐水配成药液]，1 次/d；假手术组和模型组每只给予等体积生理盐水，1 次/d，连续3 个月。各组给予普通饲料、自由饮水和活动。

1.4.2 取材 连续干预3 个月后，用2%戊巴比妥钠40 mg/kg注射麻醉处死各组大鼠，分离第1，2 腰椎，迅速放入液氮中；取左侧胫骨用于骨密度检测；选择大鼠腰椎用于提取蛋白，并将各组每4 只大鼠腰椎蛋白混合成1 个样品，即每组分为3 个蛋白样品用于检测。

实验动物造模过程的相关问题造模目的 探究骨疏康保护骨质疏松模型大鼠骨代谢的机制，对差异表达蛋白进行生物信息学分析动物来源及品系 3 月龄清洁级雌性SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司模型与所研究疾病的关系利用TMT 标记联合液相色谱-串联质谱法技术研究骨疏康干预骨质疏松症大鼠腰椎的差异蛋白表达，运用生物信息学进行GO 及信号通路分析，预测骨疏康治疗骨质疏松症可能的作用靶点造模技术描述 参考文献[9]的方法，施行大鼠双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型动物数量及分组方法 36 只6 月龄大鼠按照随机数字表法分成骨疏康组、模型组、假手术组，每组12 只造模后实验观察指标 ①差异表达蛋白；②GO 功能富集分析；③信号通路分析；④蛋白质相互作用网络分析造模后动物处理 骨疏康干预12 周后，麻醉下处死各组大鼠，分离第1，2腰椎，迅速放入液氮中，用于提取蛋白；取左侧胫骨用于骨密度检测伦理委员会批准 实验方案经福建省中医药科学院动物实验伦理委员会批准

1.4.3 大鼠胫骨骨密度检测 采用双能X 射线骨密度仪检测各组大鼠左侧胫骨骨密度，严格按照仪器说明进行操作。

1.4.4 腰椎总蛋白制备 取腰椎样品加入适量SDT 裂解液，沸水浴后，离心取上清液提取蛋白质。采用 BCA 法进行蛋白质定量后-80 ℃保存。

1.4.5 TMT 标记及肽段分级 每个样品取适量蛋白质进行胰蛋白酶酶解，肽段定量(A280)。按照TMT 标记试剂盒说明书，每份样品分别取100 μg 肽段进行标记后等量混合再进行分级。首先采用乙腈和0.1%三氟乙酸(TFA)进行柱平衡，然后将混合的标记肽段样品上样，将其脱盐处理、梯度洗脱、真空干燥后用适量0.1%FA 复溶冻干样品，A280测定肽段浓度。

1.4.6 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 采用纳升流速的HPLC 液相系统Easy nLC 对每份分级样品进行分离；样品经色谱分离后用Q-Exactive 质谱仪进行质谱分析，正离子检测方式，母离子扫描范围300-1 800 m/z。多肽和多肽碎片的质量电荷比采集方式：每次全扫描后采集20 个碎片图谱(MS2 scan，HCD)。

1.4.7 蛋白质鉴定和定量分析 LC-MS/MS 质谱分析原始数据使用软件Mascot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4 进行查库鉴定及定量分析。蛋白数据库为：UNIPROT_Rattus_norvegicus__；定量方式根据唯一肽段定量值的中位数。最大漏切数2；可变修饰有Oxidation (M)，TMT6/10 plex(Y)，固定修饰Carbamidomethyl (C)，TMT6/10 plex(N-term)，TMT6/10 plex(K)；可信肽段的筛选标准≤0.01。

1.5 主要观察指标①差异表达蛋白；②Gene ontology(GO)功能富集分析(Blast2Go 软件， Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG， 数据库，

1.6 统计学分析和生物信息学分析应用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计学处理，结果以±s表示，根据数据是否符合正态性检验，选择非参数检验；研究数据为多组间均数比较，采用单因素方差分析再进一步两两比较；P< 0.05 认为差异有显著性意义。差异蛋白筛选条件为：倍数变化 >1.2 倍且P< 0.05(上调 >1.2 倍或者下调 < 0.83)，符合条件进行后续GO、KEGG 通路、蛋白互作分析和展示。

2 结果 Results

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36 只，分为3 组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组大鼠胫骨骨密度比较与假手术组相比，模型组骨密度显著降低(P< 0.05)；与模型组相比，骨疏康组骨密度显著提高(P< 0.05)；骨疏康组与假手术组骨密度比较差异无显著性意义(P> 0.05)，见表1。

表1 ｜各组大鼠胫骨骨密度比较 (±s，n=12，g/cm2)Table 1 ｜Comparison of bone mineral density of the rat tibia among groups表注：与假手术组比较，aP< 0.05；与模型组比较，bP< 0.05组别 骨密度假手术组 0.模型组 0.骨疏康组 0.

2.3 蛋白质鉴定及差异表达蛋白质筛选在3 组中共鉴定到3 614 个蛋白质。以上述实验方法中提到的差异蛋白筛选条件为标准，进行了组间差异表达蛋白数目比较。模型组与假手术组相比，共有125 个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有76 个，下调的蛋白有49 个；与模型组相比，给予骨疏康治疗后，共有81 个差异表达蛋白质，其中上调的蛋白有32 个,下调的蛋白有49 个。蛋白质定量结果统计以火山图形式展示，见图1，2。

2.4 差异表达蛋白质GO 功能富集分析

2.4.1 去势手术后差异表达蛋白质GO 功能富集分析 将模型组与假手术组数据进行差异表达蛋白GO 基因功能注释及富集分析，结果发现他们主要包含细胞、细胞器、膜部分、胞外区域等细胞组分(cellular compoent，CC)；具有结合、结构分子活性、外切酶活性等分子功能(molecular function，MF)；并参与细胞过程、核转录mRNA 分解代谢过程、应激反应等生物过程(biological process，BP)，见图3。

2.4.2 骨疏康治疗后差异表达蛋白质GO 功能富集分析 将骨疏康组与模型组数据进行差异表达蛋白GO 基因功能注释及富集分析，结果发现他们主要包含细胞、细胞器部分、蛋白复合物、膜部分等细胞组分；具有核酸模板转录、RNA 生物合成等分子功能；并参与免疫球蛋白受体结合、血管内皮生长因子受体结合等生物过程，见图4。

2.5 差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析

2.5.1 去势手术后差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析 将模型组与假手术组数据进行差异表达蛋白富集分析，富集到KEGG pathway 共14 条，见图5。其中，富集程度显著性最高的有1 型糖尿病代谢、RNA 降解、嘌呤和叶绿素代谢、抗原加工和提呈、补体和凝血级联反应等重要通路。

2.5.2 骨疏康治疗后差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析 将骨疏康组与模型组数据进行差异表达蛋白富集分析，富集到KEGG pathway 共3 条，包括酪氨酸代谢、JAK-STAT 信号通路、乙醇代谢等重要通路，见图6。

2.6 共同差异表达蛋白统计统计模型组/假手术组差异蛋白在骨疏康组的表达情况。模型组表达上调，而在骨疏康组表达下调的蛋白有25 个；模型组表达下调，而在骨疏康组表达上调的蛋白有2 个，即模型组共有27 个异常表达的蛋白在骨疏康组得到纠正，见表2。

2.7 共同差异表达蛋白PPI 分析为获得蛋白质的更多功能信息，通过STRING 蛋白相互作用网络分析工具分析，发现共同差异蛋白中Gstz1[10]、Cxxc1[11]、Mecp2、Aldh3b1、Tspan14[12]、Ryr1、Myoz1 位于功能网络节点，其余蛋白均在网络边缘，见图7。图中Gstz1、Cxxc1、Mecp2 之间存在相互作用，Aldh3b1 与Tspan14、Ryr1 与Myoz1 之间存在相互作用。

3 讨论 Discussion

3.1 既往他人的研究贡献及存在不足随着骨质疏松症发病率逐年攀升，成为世界性健康问题和社会公共问题[13]。探索骨疏康等中医药治疗骨质疏松症的作用机制，可为临床应用提供更多实验依据，为骨质疏松症的中医药治疗及预防提供更大的优势和理论补充。临床研究表明，骨疏康治疗原发性骨质疏松症效果显著[14-15]，从调整全身功能入手防治骨质疏松症为其特点。药理学研究显示骨疏康对骨吸收、骨形成、修复骨微结构等方面具有一定作用[16]：WANG 等[17]实验表明骨疏康可抑制去卵巢小鼠破骨细胞的生成和刺激成骨细胞的生成；CHAI 等[18]研究发现骨疏康干预通过上调相关成骨因子而显著增强BMP-2/Smads 信号通路，且改善骨质疏松大鼠的骨微结构；LI 等[19]用不同剂量的骨疏康处理卵巢切除术小鼠，能显著提高维生素D 和钙的代谢水平。随着蛋白组学的迅速发展，成为近年来的研究热点，部分文献报道骨疏康防治骨质疏松症的具体作用机制尚未阐释其相关作用靶点，其分子机制尚未明确。

3.2 研究的意义利用新兴的蛋白组学技术和生物信息学分析，从蛋白质组学角度挖掘骨疏康治疗骨质疏松症的新靶点和信号通路，为临床应用提供实验基础。

此次研究中骨疏康组大鼠骨密度显著提高。从差异表达蛋白GO 功能富集分析来看，骨疏康组/模型组差异蛋白主要参与免疫球蛋白受体结合、血管内皮生长因子受体结合等生物过程。最新研究表明免疫球蛋白家族23(IGSF23)介导破骨细胞分化，抑制其表达可逆转去卵巢小鼠的骨流失[20]；并且研究也显示血管内皮生长因子与血管内皮生长因子受体结合诱导血管生成，而血管侵入参与骨重建过程[21-22]。从差异表达蛋白KEGG 通路分析来看，骨疏康组/模型组差异蛋白主要富集于酪氨酸代谢、乙醇代谢、JAK-STAT 信号通路等，同时与模型组/假手术组差异蛋白共同富集于酪氨酸代谢信号通路。已有研究表明将四环素与一个酪氨酸结合形成一个新化合物抑制了去卵巢后所致骨小梁的丢失，改善骨小梁空间结构，增加骨小梁板的厚度，其机制与抑制破骨细胞介导的骨吸收有关[23]。从共同差异表达蛋白来看，模型组Zc3hc1[24-25]、Svs3b、Hbe2、Mecp2、Myoz1 等27 个 异 常 表达蛋白在骨疏康组得以纠正，提示了骨疏康的治疗作用。结合骨质疏松症病理生理特点以及GO 功能注释、KEGG 通路富集分析、PPI 互作分析结果筛选出与骨代谢相关的Mecp2、Aldh3b1、Ryr1、Myoz14 个共同差异表达蛋白和重要通路进行分析。

表2 ｜模型组与骨疏康组的共同差异表达蛋白统计Table 2 ｜Statistics of co-differentially expressed proteins betweenGushukanggroup and model group表注：*为模型组表达下调的差异蛋白序号 蛋白名称 中文名称 基因名称 模型组vs. 假手术组 骨疏康组vs. 模型组P 值 差异倍数 P 值 差异倍数1 RCG - Svs3b 0.000 6.329 0.000 0.507 2 Epsilon 2 globin ε2 珠蛋白 Hbe2 0.000 5.373 0.001 0.526 3 Zc3hc1 protein Zc3hc1 蛋白 Zc3hc1 0.010 2.493 0.009 0.568 4 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 - 0.002 2.071 0.021 0.760 5 Signal-induced proliferation-associated 1 信号诱导增殖相关1 Sipa1 0.046 1.883 0.048 0.606 6 Soluble calcium-activated nucleotidase 1 可溶性钙激活核苷酸酶1 Cant1 0.005 1.730 0.006 0.757 7 Uncharacterized protein 未鉴定蛋白 - 0.005 1.727 0.038 0.792 8 Maleylacetoacetate isomerase 顺丁烯二酰乙酰乙酸酯异构酶 Gstz1 0.016 1.600 0.021 0.832 9 Lipocalin 7, isoform CRA_a 脂蛋白7，CRA_a 亚型 Tinagl1 0.004 1.595 0.024 0.739 10 Protein unc-45 homolog A 蛋白质unc-45 同源物A Unc45a 0.004 1.539 0.014 0.683 11 Ubiquitin-associated and SH3 domain-containing, A 泛素相关和SH3 结构域，A Ubash3a 0.006 1.538 0.026 0.806 12 Churchill domain-containing 1 包含丘吉尔域1 Churc1 0.014 1.533 0.007 0.611 13 CCR4-NOT transcription complex, subunit 8 CCR4-NOT 转录复合物，亚基8 Cnot8 0.019 1.504 0.011 0.771 14 Aldehyde dehydrogenase family 3 member B1 乙醛脱氢酶家族3 成员B1 Aldh3b1 0.002 1.498 0.003 0.766 15 Leucine-rich repeat flightless-interacting protein 2 富含亮氨酸重复序列的非飞行相互作用蛋白2 Lrrfip2 0.002 1.486 0.001 0.633 16 Coiled-coil domain-containing 115 含线圈域115 Ccdc115 0.001 1.398 0.005 0.765 17 Ryanodine receptor 1 兰尼碱受体1 Ryr1 0.043 1.317 0.003 0.761 18 CXXC finger 1 (PHD domain) CXXC Finger 1(PHD 域) Cxxc1 0.019 1.317 0.025 0.784 19 Tetraspanin 川芎嗪 Tspan14 0.011 1.293 0.006 0.817 20 Lipin 1 脂蛋白1 Lpin1 0.027 1.286 0.036 0.826 21 RNA-binding motif protein 27 RNA 结合基序蛋白27 Rbm27 0.035 1.265 0.015 0.771 22 Ribosome assembly factor mrt4 核糖体装配因子MRT4 Mrto4 0.003 1.259 0.004 0.804 23 BH3-interacting domain death agonist BH3 相互作用域死亡激动剂 Bid 0.003 1.259 0.023 0.807 24 Phosducin-like protein 3 磷素样蛋白3 Pdcl3 0.029 1.257 0.007 0.713 25 Amino acid transporter 氨基酸转运蛋白 Slc1a3 0.009 1.205 0.002 0.726 26 *Methyl-CpG-binding protein 2 甲基-CpG 结合蛋白2 Mecp2 0.040 0.807 0.010 1.227 27 *Myozenin 1 肌红蛋白1 Myoz1 0.023 0.802 0.041 1.383

图1 ｜模型组/假手术组蛋白质定量结果Figure 1 ｜Protein quantitative analysis between sham operation group and model group图注：图中红色点为显著性差异表达的蛋白，黑色点为无差异变化的蛋白

图2 ｜骨疏康组/模型组蛋白质定量结果Figure 2 ｜Protein quantitative analysis betweenGushukanggroup and model group图注：图中红色点为显著性差异表达的蛋白，黑色点为无差异变化的蛋白

图3 ｜模型组/假手术组GO 功能富集分析Figure 3 ｜Functional enrichment analysis of gene ontology between sham operation group and model group图注：BP 为生物过程；MF 为分子功能；CC 为细胞组分

图4 ｜骨疏康组/模型组 GO 功能富集分析Figure 4 ｜Functional enrichment analysis of gene ontology betweenGushukanggroup and model group图注：BP 为生物过程；MF 为分子功能；CC 为细胞组分

图5 ｜模型组/假手术组KEGG 通路富集分析Figure 5 ｜KEGG enrichment analysis between sham operation group and model group图注：富集到KEGG pathway 共14 条。P值颜色越深，富集的程度越高，相应的P值越小

图6 ｜骨疏康组/模型组KEGG 通路富集分析Figure 6 ｜KEGG enrichment analysis betweenGushukanggroup and model group图注：富集到KEGG pathway 共3 条。P值颜色越深，富集的程度越高，相应的P值越小

图7 ｜共同差异表达蛋白质相互作用网络Figure 7 ｜Co-differentially expressed protein interaction network

Mecp2 是一种能与甲基化DNA 特异性结合的甲基化调控蛋白[26]。文献报道，Mecp2 缺乏或突变可致骨小梁质量下降，骨矿物质含量和骨形成率相应减少[27]；也使得成骨细胞形态改变和数量减少，与骨形成相关的Ⅰ型胶原、Runx2 等mRNA 表达下降[28]。XIAO 等[29]首次建立人类B 细胞基因表达研究，实时PCR 证实了低骨密度与高骨密度组之间8 个基因的差异表达，研究证实低骨密度组中Mecp2 下调也与以往研究一致[30]。此次研究发现Mecp2 在模型组中表达下调，而在骨疏康组中表达上调，其表达趋势与其他蛋白不同，由此推测骨疏康可能通过提高Mecp2 的甲基化水平从而抑制骨量减少，具体机制有待进一步探究。Aldh3b1 是乙醛脱氢酶ALDH 家族成员，其功能与细胞内活性氧的清除相关。研究发现骨质疏松症与氧化应激密切相关[31]，绝经后妇女体内雌激素水平和抗氧化水平随着年龄增大而下降，机体内累积的活性氧无法及时清除，从而诱导了氧化应激的发生导致成骨细胞和骨细胞的损伤[32]。而ALDH 可以通过多种醛类代谢减少氧化应激。Ryr1 是骨骼肌中的主要Ca2+离子通道，严格调控正向和逆向的钙通量，对维持Ca2+稳态有着直接或间接的作用[33-34]，而钙稳态的失调可引发骨质疏松症等病理性结果。Myoz1 是一种主要在骨骼肌中表达的α-肌动蛋白和γ-丝氨酸结合的Z 线蛋白，影响肌纤维发育[35]。越来越多的研究证明肌肉与骨质疏松之间密切的病理机制，在骨质下降的同时一定程度影响骨骼肌含量[36-37]。此次研究中骨疏康组Myoz1表达上调，其表达趋势与其他蛋白不同，故推测骨疏康很可能通过上调Myoz1 表达水平影响骨骼肌含量从而起到骨保护作用。

从通路分析可见，骨疏康抗骨质疏松的分子机制与参与骨代谢的信号通路有关。酪氨酸是体内重要的氨基酸，已有文献表明氨基酸代谢利于骨质疏松症的治疗和预防[38]。同时酪氨酸是合成甲状腺素的主要原料，而过量的甲状腺素会引发骨质疏松症[39]。Jak/Stat 信号通路参与了胚胎形成、免疫反应、细胞增殖等生物学过程。相关研究表明一些炎症因子、激素可影响Jak/Stat 通路而导致骨代谢变化[40]。马铭等[41]研究结果发现炎症因子白细胞介素37 可能通过调节巨噬粒细胞集落刺激因子的表达和IL-6-JAK2/STAT3 信号通路的激活来抑制骨髓间充质干细胞的增殖并抑制成骨细胞的凋亡。也有不少中药复方通过调控该通路干预治疗骨质疏松症[42]，陈娟等[43]研究表明六味地黄丸可能通过上调JAK/STAT 通路中干扰素调节因子(IRF1)基因的表达，调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证免疫功能。长期酗酒或酒精中毒可引起骨密度的减少[44]，有研究发现腹腔注射过量的酒精可完全抑制胫骨干physi 端骨膜的形成，减少胫骨近端松质骨形成，提示了乙醇代谢与骨代谢的关系[45]。同时，大量酒精摄入对骨代谢表现出毒副作用，而这种毒副作用可能涉及促炎因子，氧化应激、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR 和RANKL/RANK 等通路参与其中[46]。

综上所述，此次研究采用TMT 蛋白质组学技术及生物信息学分析方法分析了骨疏康胶囊对骨质疏松模型大鼠腰椎蛋白质的作用，筛选出差异表达的蛋白并分析，结果显示骨疏康胶囊可能通过调控差异蛋白及酪氨酸代谢、JAK-STAT 等重要信号通路参与保护骨质疏松模型大鼠的骨代谢过程。该研究为骨质疏松症的中医药治疗提供了新的靶点和研究新思路，对骨质疏松症的发病机制、新靶点药物开发、临床治疗等具有重要指导意义。

作者贡献：林若慧负责数据整理、论文撰写；陈赛楠、黄景文负责动物实验；叶云金检索文献；陈娟、谢丽华参与动物实验；李生强负责项目设计；葛继荣进行实验指导。

经费支持：该文章接受了“福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2019R1003-1)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经福建省中医药科学院动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经福建中医药大学统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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文章来源：北京中医药 网址: http://bjzyy.400nongye.com/lunwen/itemid-42156.shtml

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