0 引言 Introduction
膝骨关节炎是临床上常见的骨科疾病之一，其发病率正逐年上升，它是导致中老年人疼痛、功能障碍和残疾的最常见原因之一[1]。膝骨关节炎的具体发病机制尚不明确，与遗传、肥胖、年龄、性别、炎症、创伤和代谢功能障碍有关[2]。目前治疗膝骨关节炎主要是控制体质量、物理治疗、药物对症治疗及手术治疗，以缓解疼痛，改善膝关节功能[3]，其中药物治疗包括西药非类固醇类抗炎药和中药辨证论治治疗。
姜黄素是中药姜黄的主要活性成分，已有研究通过构建自发性与创伤性骨关节炎老鼠模型服用姜黄素[4]，证明姜黄素治疗改善了白细胞介素1β 诱导的自噬抑制、细胞活力降低和凋亡，表明姜黄素通过Akt/mTOR 信号传导途径诱导的自噬抗骨关节炎作用。也有研究通过构建内侧半月板不稳定的小鼠骨关节炎模型[5]，发现姜黄素和包裹姜黄素的纳米颗粒均抑制了软骨细胞中促炎性递质白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶1(MMP1)，3 和13、聚集蛋白聚糖酶ADAMTS5 的mRNA 表达，并上调了软骨保护性转录调节因子CITED2。还有研究通过构建碘乙酸单钠(MIA)诱导的骨关节炎大鼠模型服用姜黄素[6]，表明姜黄素可以阻断骨关节炎大鼠的Toll 样受体4/核转录因子κB 信号通路降低炎症水平。上述研究都是通过前期基础研究或者查找文献发现可能的相关靶点和相关通路，研究的靶点和通路有限，但中药治疗疾病是多靶点多通路的作用机制，需要应用大数据挖掘现有所有关于姜黄素和膝骨关节炎有关的靶点通路。
文章通过生物信息学与网络药理学技术手段，筛选和预测姜黄素治疗膝骨关节炎的潜在作用靶点和信号通路，为后期中药的研发与临床应用提供科学依据。
表1 ｜姜黄素治疗膝骨关节炎作用靶点筛选所用数据库基本信息Table 1 ｜Basic information of data about curcumin in the treatment of knee osteoarthritis数据库 网址TCMSP 数据库 STITCH 数据库 数据库 Drugbank 数据库 数据库 蛋白质数据库 数据库 数据库 数据库 数据库 GeneCards 数据库 数据库 数据库
1 资料和方法 Data and methods
1.1 资料库及研究流程正文所涉及的资料库见表1。研究流程见图1。
1.2 姜黄素相关作用靶点的收集与筛选首先以“Curcumin”为关键词，通过 筛 选TCMSP，STITCH，BindingDB，Drugbank，SEA 和SwissTargetPrediction数据库得到与姜黄素相关的靶点[7-12]，经合并去重后，统一在Uniprot 蛋白质数据库标准化蛋白质靶点信息[13]。
在NCBI 旗下的GEO 数据库中[14]，以“Curcumin”为关键词检索，获得编号为 GSE 的芯片数据原始文件[15]，该芯片中包含了24 个姜黄素干预组与对照组数据。使用数据库自带的GEO2R分析工具，自定义分组后保存所有结果，保存为geo.csv 文件，使用R 语言选择P< 0.05，logFC>1 或logFC<-1 为限定值的显著差异基因，并制作火山图。应用“Limma”“gplots”“WGCNA” 程 序包利用GEO 数据库下载的GSE_series_ 数据获得表达矩阵和分组信息，绘制差异基因的热图。最后将上述6 个药物数据库获得的相关作用靶点与在GEO 数据库获得的差异表达基因提取并集，即获得姜黄素药理作用相关的预测靶点。
图1 ｜姜黄素治疗膝骨关节炎的关键分子机制研究流程图Figure 1 ｜Flow chart of key molecular mechanisms of curcumin in the treatment of knee osteoarthritis
1.3 筛选膝骨关节炎的疾病靶点以“knee osteoarthritis” 为 关 键 词，通 过 筛 选TTD，OMIM，DisGeNET，Drugbank，GeneCards 疾病数据库[16-19]，合并去重后获得膝骨关节炎疾病相关靶点。利用R 程序“VennDiagram”包绘制膝骨关节炎疾病靶点和姜黄素预测靶点绘制韦恩图，得到药物-疾病共同靶点。
1.4 构建蛋白相关作用关系网络图和拓扑学分析 将上述药物-疾病共同靶点输入STRING 数据库[20]，选取minimum required interaction score>0.9， 构 建蛋白质- 蛋白质相互关系(proteinprotein interaction，PPI)网络图，将结果保存成tsv 文件，借助Cytoscape 软件构建PPI 网络，借助Cytoscape 的NetworkAnalyzer 工具分析包计算网络中节点的拓扑学属性，涵盖自由度(Degree)、介度(Betweeness)、聚类系数(Clustering coefficient)等多个参数，然后根据Degree 值设置大于中位数的为关键靶点，用菱形表示，重新构建PPI 网络图。
1.5 GO 富集分析与KEGG 通路分析在R 软件中安装 Bioconductor 软件包“”，将药物-疾病共同靶点转换成entrezID。然后通过安装“clusterProfiler” 和“pathview” 包，将已转换的 entrezID，以P< 0.05，Q<0.05 进行药物-疾病共同靶基因GO 与KEGG 功能富集分析，并将结果以气泡图形式输出，并绘制出主要通路图。
1.6 构建姜黄素治疗膝骨关节炎的姜黄素-共同靶点-通路网络图对“1.4”中获得的药物与疾病共同靶点和“1.5”中获得的通路名称，制作和 文件，导入Cytoscape 软件，再次利用NetworkAnalyzer 工具包计算网络中节点的拓扑学属性，然后根据degree 值设置药物、靶点和通路标志大小，菱形表示姜黄素，圆形表示靶点，矩形表示通路，构建姜黄素-共同靶点-通路网络图。
1.7 姜黄素关键靶点与靶蛋白的分子对接为观察姜黄素进入机体后，能否和机体的靶蛋白结合进而发挥药效，文章将1.3 中根据degree 值设置大于中位数获得的关键靶点与姜黄素这个化合物进行分子对接，分子对接能有效确定与靶受体部位空间、作用力和电性特征匹配小分子化合物，预测与靶点结合的可能性[21]，文章借助IGEMDOCK 软件将潜在关键治疗靶点与靶蛋白进行对接，进一步验证化合物靶点预测的准确性[22]。首先将潜在关键治疗靶点输入蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)中[23]，找到相应蛋白的PDBID，保存为pdb 格式。从pubchem数据库中下载Curcumin 的2D 结构的sdf格式[24]，然后通过OpenBabel 软件将其转化为mol2 格式，将靶蛋白数据信息和Curcumin 的mol2 文件导入IGEMDICK 软件进行分子对接，得到分子对接数据。
1.8 主要观察指标主要包括筛选的基因靶点及其相关通路。
2 结果 Results
2.1 姜黄素相关作用靶点的收集与筛选通过筛选上述药物数据库得到与姜黄素作用相关的靶点，合并去重后得到339个靶点，见图1。在GSE 的芯片中包含了12 个姜黄素干预U937 细胞(人类单核细胞系，The human monocytic cell line)的干预组和12 个对照组，对其结果使用GEO2R 进行在线分析，再根据P<0.05，logFC>1 或logFC<-1 为限定值，得到显著差异基因397 个，其中上调基因238 个，下调基因151 个，并制作火山图，上调基因用红色表示，下调基因用绿色表示，见图2。根据表达矩阵和分组信息，绘制差异基因的热图，见图3。最后将上述药物数据库获得的靶点与差异表达基因提取并集，即获得姜黄素作用的可能相关靶点(728 个)，见图1。
2.2 筛选膝骨关节炎的疾病靶点通过筛选上述疾病数据库合并去重后获得膝骨关节炎疾病相关靶点1 903 个。利用R 程序包绘制膝骨关节炎疾病靶点和姜黄素预测靶点绘制韦恩图，得到129 个共同靶点，见图4。
2.3 构建蛋白质互作网络图和拓扑学分析将上述药物-疾病共同靶点输入STRING 数据库，得到PPI 互作网络图，将结果保存成tsv 文件，借助Cytoscape软件构建PPI 网络，如图5，相互作用网络包含54 个节点(nodes)和241 条边(edges)。图5 中1 个节点的度(degree)表示网络中和节点相连的路线的条数，degree 越大表示该节点与其他节点的关系越密切，所处的位置在网络中越重要。通过NetworkAnalyzer 工具分析选取，选取Degree ≥15(中位数)，得到8 个关键靶点，关键靶点之间共26 条边，关键靶点详细介绍见表2。
2.4 GO 富集分析与KEGG 通路分析结果将 129 个共同靶点经R 语言运行后GO分析与KEGG 功能富集分析，分别得到125 个生物学进程条目和 37 个KEGG 信号通路条目，并将结果选取前20 条以气泡图形式输出，见图6，7，气泡的大小表示该条目下差异基因的个数，点越大表示基因数越多。颜色表示调整后的P值，越红表示调整后的P值越小，富集越明显。GO 分析结果显示，富集基因数目>10 的条目有11 个，主要与DNA 结合转录因子，DNA 结合转录激活剂活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性，内肽酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性、金属肽酶活性及磷酸酶结合有关。KEGG 功能分析显示：共同靶点主要富集于白细胞介素17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和低氧诱导因子1 信号通路[25]，其中红色气泡的白细胞介素17 信号通路和肿瘤坏死因子通路更为重要，选择些条通路进行绘制，见图8，9。在这37 条通路中，根据count 值排序，大于中位数(12)的通路由大到小依次是PI3K-Akt(20)、MAPK(18)、白细胞介素17(16)、肿瘤坏死因子(16)和缺氧诱导因子1 信号通路(13)。
2.5 构建姜黄素治疗膝骨关节炎的姜黄素-共同靶点-通路网络图将药物与疾病共同靶点和通路构建姜黄素-共同靶点-通路网络图，见图10，其中节点越大，说明该节点越重要，相互作用网络包含129 药物-疾病共同靶点、37 个KEGG 信号通路、168 个节点和476 条边。共同靶点根据degree 排名，前10 位的靶点是AKT1，NFKB1，RELA，IKBKB，CHUK，MAPK14，JUN，IKBKG，EGFR 和GSK3B。
2.6 姜黄素关键靶点与靶蛋白的分子对接结果将姜黄素关键靶点进行分子对接判断其进入机体后能否与靶蛋白稳定结合。IGEMDOCK 软件的分子对接结果是以能量的高低来判断姜黄素关键靶点与靶蛋白结合程度的，能量值越小，与靶蛋白结合的亲和力越大，IGEMDOCK对接结果表明对接能量值均低于-100，见表3，结果表明姜黄素关键靶点与靶蛋白有很好的结合性，从表3 中可以看出胰岛素样生长因子1 受体(IGF1R)与3D94 结合亲和力最强，对其进行可视化分析，见图11。
图2 ｜ GEO 芯片数据膝骨关节炎差异基因的火山图Figure 2 ｜Volcanic map of knee osteoarthritis-related differential genes based on GEO chip data图注：红色表示上调基因，绿色表示下调基因
图3 ｜ GSE 中姜黄素干预差异基因表达热图Figure 3 ｜Differential gene expression heatmap of curcumin intervention in GSE图注：左边红色表示干预组，黄色表示对照组，中间的红色表示上调基因，绿色表示下调基因
图4 ｜ 药物-疾病共同靶点的韦恩图Figure 4 ｜ Venn diagram of drug-disease common targets图注：Disease 表示膝骨关节炎疾病，Drug 表示姜黄素，两圆共同部分显示129 个共同靶点
表2 ｜姜黄素治疗膝骨关节炎关键靶点基本信息Table 2 ｜Basic information on key targets of curcumin in the treatment of knee osteoarthritis
图5 ｜ 药物-疾病共同靶点的PPI 网络图Figure 5 ｜Protein-protein interaction network diagram of drug-disease common targets图注：菱形节点表示Degree ≥15 的靶点，其他椭圆节点表示Degree<15 的靶点，节点越大，表示该节点在网络中越重要。MAPK3 为丝裂原激活的蛋白激酶3，EGFR 为表皮生长因子受体，ESR1 为雌激素受体1，MDM2 为E3 泛素蛋白连接酶Mdm2，CYP19A1 为芳香酶，MAPK14 为丝裂原激活的蛋白激酶14；AR 为雄激素受体，IGF1R 为胰岛素样生长因子1 受体
图6 ｜ 药物-疾病共同靶点的GO 分析的气泡图(排名前20)Figure 6 ｜Bubble charts of GO analysis of drug-disease common targets (top 20)
图7 ｜ 药物-疾病共同靶点的KEGG 通路分析的气泡图(排名前20)Figure 7 ｜Bubble diagram of KEGG pathway analysis of drug-disease common targets (top 20)
图8 ｜ KEGG 通路-白细胞介素17 信号通路Figure 8 ｜KEGG pathway-interleukin-17 signaling pathway图注：图中的节点(矩形框)代表某一基因(蛋白质)，白色节点代表通路蛋白，红色代表姜黄素的关键作用靶蛋白，实线箭头代表激活，虚线箭头代表间接关系，两个箭头中间带圈的表示表达。AP-1 为激活蛋白1，Casp 为胱冬酶；NF-κB 为核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强；HSP90 为热休克蛋白90；IKK 激酶包括IKKα，IKKβ，IKKγ；GSK-3β 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶；MMP 为基质金属蛋白酶；MAPK 为有丝分裂原活化蛋白激酶
图9 ｜ KEGG 通路-肿瘤坏死因子信号通路Figure 9 ｜KEGG pathway-tumor necrosis factor signaling pathway图注：图中节点(矩形框)代表某一基因(蛋白质)，白色节点代表通路蛋白，红色代表姜黄素的关键作用靶蛋白，实线箭头代表激活，虚线箭头代表间接关系，两个箭头中间带圈的表示表达。CASP3 为胱冬酶3；TNFR1 为肿瘤坏死因子1；AP-1 为激活蛋白1；p38 为MAPK14 别名；MMP 为基质金属蛋白酶；NF-κB 为核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强；IKK 激酶包括IKKα，IKKβ，IKKγ；Akt 为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；JUN 是1 号染色体的基因；FOS 为一类核蛋白转录因子；NOD2 是位于16 号染色体的基因；Ptgs2：前列腺素内过氧化物合酶2
图10 ｜ 姜黄素-共同靶点-通路网络图Figure 10 ｜Network diagram of curcumincommon target-pathway图注：黄色的菱形节点表示姜黄素，绿色的椭圆节点表示疾病-中药共同靶点，红色矩形节点表示通路。Curcumin为姜黄素；AKT1 为一种丝氨酸，苏氨酸激酶编码 蛋 白；NFKB1 为B 细胞κ 轻肽基因增强子核因子1；RELA 为网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A；IKBKB 为B细胞κ 轻肽基因增强子抑制因子；CHUK 为螺旋环螺旋结构域扩散激酶；MAPK14 为丝裂原活化蛋白激酶14；JUN 为是禽肉瘤病毒17 的转化基因；EGFR 为表皮生长因子受体；GSK-3β 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶
3 讨论 Discussion
膝骨关节炎作为一种常见的慢性、退行性骨关节病，发病率逐年上升，已严重影响人类健康，特别是老年人[26]。目前治疗膝骨关节炎的药物主要以非类固醇类药物消炎镇痛，尚不能根治[27]。骨关节炎属于祖国医学“膝痹”和“鹤膝风”范畴[28]，姜黄主治风湿痹痛证，已经被证实治疗膝骨关节炎有效[29]，但现有研究关于姜黄素治疗膝骨关节炎的靶点和通路有限，大部分通过前期试验或者查阅文献所得，所以文章旨在应用大数据挖掘，通过网络药理学的方法探讨姜黄素治疗膝骨关节炎的分子作用机制。
图11 ｜ 胰岛素样生长因子1 受体靶点与3D94 蛋白分子对接构象图Figure 11 ｜Molecular docking image between insulin-like growth factor receptor and 3D94图注：姜黄素化学结构用品红色表示，其他是3D94 靶蛋白结构，胰岛素样生长因子1 受体(IGF1R)在口袋内，S-ASP-1123，M-D94-1，S-MET-1052，M-VAL-1113，M-GLY-1122，M-CYS-1111，H-ASN-1110和M-ARG-1109 都是附近氨基酸残基的名称
表3 ｜姜黄素与靶蛋白的分子对接基本信息表Table 3 ｜Basic information of molecular docking between curcumin and target proteins靶点名称 PDBID 能量(kJ/mol) 范德华力(kJ/mol) 氢键(kJ/mol)MAPK3 2ZOQ -124.32 -13.234 -11.087 EGFR 2XKN -137.249 -112.552 -24.697 ESR1 5ACC -127.858 -118.358 -9.5 MDM2 1TTV -109.099 -95.937 -13.162 CYP19A1 5JL6 -137.138 -109.548 -27.59 MAPK14 6SFO -135.681 -124.718 -10.963 AR 3FY9 -150.185 -130.254 -19.931 IGF1R 3D94 -167.468 -131.913 -35.555
文章通过GEO 数据库得到显著差异基因397 个，其中上调基因238 个，下调基因151 个，筛选出129 个药物-疾病共同靶点，按Degree 值筛选出MAPK3，EGFR，雌激素受体1，MDM2，CYP19A1，MAPK14，雌激素受体和胰岛素样生长因子1 受体共计8 个关键靶点。MAPK 在骨关节炎软骨细胞中导致促炎性细胞因子增高，趋化因子和信号传导酶的过度表达，在骨关节炎发展的MAPK 信号通路的中起着重要作用[30]。EGFR 受体蛋白通过RAS-RAF-MEK-ERK 途径(MAPK/ERK 通路)参与细胞增殖，通过PI3K-AKT-mTOR途径参与细胞存活[31]。软骨细胞中雌激素靶向活化雌激素受体1，通过抑制ERK 磷酸化激活，进而抑制ERK 信号通路，促进自噬流的形成，激活自噬，减少凋亡，进而引起软骨细胞的增殖[32]。CYP19A1 是雌激素合成过程中的一个关键酶，胰岛素样生长因子1 也能通过配体非依赖途径激活雌激素受体而促进靶基因表达[33]。雄激素受体抑制白细胞介素1，6 的产生，间接抑制破骨细胞形成，从而阻碍骨关节炎病程[34]。MDM2 是骨关节炎中肿瘤坏死因子α 介导的PI3K-Akt-MDM2 信号通路上的下游因子[35]。在37 个信号通路中，PI3K-Akt、MAPK、白细胞介素17、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 信号通路尤为重要。PI3K/Akt 信号通路是抑制炎症和软骨细胞凋亡的重要途径[36]，MAPK信号通路是骨关节炎发展中导致促炎性细胞因子、趋化因子和信号传导酶的过度表达的关键通路，白细胞介素17 信号通路中的白细胞介素17 是一种主要由活化的T 细胞分泌[37]，产生致炎细胞因子白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子α。肿瘤坏死因子α 是正常关节骨骼中骨代谢的关键因子dickkopf-1 的关键诱导剂，参与了关节重塑[25]，在软骨动态失调中通过驱动炎症级联反应和软骨降解而发挥关键作用[38]，关节软骨由于缺乏毛细血管网络，因此造成低氧的微环境，而缺氧诱导因子1 参与调节关节软骨的体内平衡，一项病例对照研究发现缺氧诱导因子1α 信号通路参与了膝骨关节炎的发展。现有研究表明姜黄素通过Akt/mTOR信号通路诱导的自噬抗骨关节炎[39]，通过Toll 样受体4/核转录因子κB 信号通路降低炎症水平，参与了膝骨关节炎的发展，但缺乏通过其他抗炎和抑制软骨细胞凋亡相关通路研究，如缺氧诱导因子1α、白细胞介素17、MAPK 和肿瘤坏死因子信号通路。通过8 个关键靶点作用提示今后可开展姜黄素中的雌激素通过ERK信号通路治疗膝骨关节炎的研究，雄激素通过白细胞介素信号通路作用于膝骨关节炎。
文章GO 分析结果显示姜黄素治疗膝骨关节炎的生物学进程主要集中在与DNA 结合转录因子结合、DNA 结合转录激活剂活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性及DNA 结合转录激活因子活性此3 类条目中。KEGG 通路分析表明疾病-药物共同靶点主要富集在白细胞介素17信号通路和肿瘤坏死因子信号通路。在Cytoscope 数据中，利用“Ctrl+6”快捷键，可以看出PI3K-Akt 信号通路中姜黄素有20 个靶点参与了该过程，其中关键靶点EGFR 参与了该过程，有18 个靶点参与了MAPK 信号通路，其中有EGFR 和MAPK14 靶点，各有16 个靶点参与了白细胞介素17 信号通路和肿瘤坏死因子信号通路，其中有靶点MAPK14，13 个靶点参与缺氧诱导因子1 信号通路，其中EGFR 参与了该过程。从而可知姜黄素的重要靶点EGFR 主要通过PI3K-Akt、MAPK、缺氧诱导因子1、MAPK14 白细胞介素17 和肿瘤坏死因子信号通路发挥抗炎与抑制软骨细胞凋亡的作用。另外AKT1 靶点有27 条通路，在关键通路中与PI3K-Akt、MAPK、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 信号通路有关，NFKB1靶点和RELA 靶点各有22 条通路，在关键通路中与PI3K-Akt、MAPK、白细胞介素17、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 信号通路都有关，IKBKB 靶点涉及19 条通路，在关键通路中与PI3K-Akt、MAPK、白细胞介素17 和肿瘤坏死因子信号通路有关。
文章分子对接结果显示对接能量值均低于-100，可知姜黄素进入机体后能与相关靶蛋白较好的亲和力，姜黄素在3D94 靶蛋白的口袋内，结合位点是胰岛素样生长因子1 受体。
综上所述，姜黄素通过MAPK3、EGFR、 雌 激 素 受 体1、MDM2、CYP19A1、MAPK14、雌激素受体和胰岛素样生长因子1 受体等关键靶点与PI3K-Akt、MAPK、白细胞介素17、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1 信号通路等多条主要通路发挥抗炎和抑制软骨细胞凋亡的方式治疗膝骨关节炎，网络药理学的应用为中药研究提供了新的技术和方法，有助于高效预测相关同类药物和筛选相关靶点及通路，但该研究是以计算机模拟和大数据分析结果为基础的，后续还需要细胞或动物实验结果来验证。
作者贡献：邹昆和郭万首进行课题设计。邹昆和邓雅文资料搜集。邹昆、张启栋和刘沛数据分析。郭万首和王卫国审校。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金(，，)及北京市科技计划(首特)课题(Z1711)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
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